NAD+ (Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid) — 1000 mg

Zentrales Coenzym des zellulären Energiestoffwechsels, das in In-vitro-Modellen zur Untersuchung der Sirtuin-Signalwege und der mitochondrialen Funktion als Referenzverbindung eingesetzt wird. Fläschchen mit 1000 mg, lyophilisiertes Pulver hoher Reinheit, ≥ 99 % HPLC, durch Drittanalyse bestätigt. Nur für Forschungszwecke.

Untersuchte Forschungsbereiche

• Energiestoffwechsel in vitro
• Sirtuin-Signalwege
• Mitochondriale Funktion

Technische Daten

NAD+, NMN oder NR: Was die Wahl der Verbindung verändert

Zunächst eine Klarstellung: NAD+ ist kein Peptid. Es handelt sich um ein Coenzym, ein Dinukleotid aus einem Nicotinamid- und einem Adenin-Nukleotid, die über eine Pyrophosphatbrücke verbunden sind. Die Begriffe der Peptidchemie — Sequenz, Aminosäuren, Denaturierung — greifen hier nicht; Lyophilisation, Rekonstitution und Kühlkette hingegen schon.

Auf dem Markt werden drei Verbindungen desselben Stoffwechselwegs regelmäßig verwechselt:

Der Salvage-Pathway ordnet sie: Nicotinamid-Ribosid (NR) wird durch die Kinasen NRK1/NRK2 zu NMN phosphoryliert, anschließend wird Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) je nach Zellkompartiment durch die NMNAT-Enzyme zu NAD+ adenyliert. Freies Nicotinamid tritt über NAMPT in denselben Weg ein, ein Schritt, der als geschwindigkeitsbestimmend beschrieben wird.

Die intuitive Überlegung — „das Endprodukt direkt bereitzustellen muss doch wirksamer sein“ — ist genau die Falle. NAD+ ist durch seine beiden Phosphatgruppen groß und zweifach geladen, und die Literatur beschreibt eine schlechte Passage durch die Plasmamembran: Extrazelluläres NAD+ wird vor jeder Aufnahme weitgehend durch Ektoenzyme (CD38, CD73, NPP1) zu NMN und weiter zu NR hydrolysiert. NAD+ in ein Kulturmedium zu geben bedeutet daher häufig, seine eigenen Vorstufen zuzuführen — nach einem Abbau, den die experimentierende Person nicht kontrolliert. Ein direkter NMN-Transporter, Slc12a8, wurde im Darm der Maus beschrieben, dieser Befund wird jedoch weiterhin diskutiert.

Entscheidend sind somit zwei Kriterien: Ladung und Größe, die den Aufnahmeweg bestimmen, und die Position im Stoffwechselweg, die festlegt, wie viele enzymatische Schritte noch verbleiben.

Molarer Bezugswert für dieses Fläschchen: 1000 mg NAD+ = 1,51 mmol, entsprechend etwa 504 mg NMN oder 385 mg NR als freie Base. Ein Vergleich dieser Verbindungen bei gleicher Masse ist sinnlos — verglichen wird in Mol.

Untersuchter Wirkmechanismus

Zwei getrennte Ebenen, die man nicht vermischen sollte.

Redox-Ebene. NAD+ ist ein Hydrid-Akzeptor: Es wird zu NADH reduziert und anschließend wieder oxidiert, ohne dabei verbraucht zu werden. Dieser Zyklus speist die Glykolyse (auf Höhe der GAPDH), den Citratzyklus und Komplex I der Atmungskette. Maßgeblich ist dabei nicht die absolute Menge, sondern das NAD+/NADH-Verhältnis, das den Redoxzustand des Kompartiments festlegt.

Verbrauchende Ebene. Drei Enzymfamilien spalten NAD+ tatsächlich. Die Sirtuine (SIRT1 bis SIRT7) katalysieren NAD+-abhängige Desacylierungen und setzen dabei Nicotinamid frei — das seinerseits eine Produkthemmung ausübt — sowie O-Acetyl-ADP-Ribose. Die PARP-Enzyme verbrauchen es für die Poly-ADP-Ribosylierung im Rahmen der DNA-Schadensantwort. CD38, als bedeutender Verbraucher beschrieben, erzeugt zyklische ADP-Ribose und NAADP; für mehrere Gewebe wird eine mit dem Alter zunehmende Expression berichtet.

Kompartimentierung. Die nukleären, zytosolischen und mitochondrialen Pools stehen nicht frei im Gleichgewicht: Die jeweils kompartimentspezifische NMNAT-Isoform bildet NAD+ lokal, sodass eine Messung im Gesamtlysat lokale Schwankungen verdeckt. Ein jüngerer Forschungsstrang betrifft SARM1, eine bei axonaler Degeneration aktivierte NADase.

Was die Literatur zeigt

Die Literatur beschreibt in mehreren Tiermodellen und einigen menschlichen Geweben einen Rückgang der NAD+-Gewebespiegel mit dem Alter. Diese Beobachtung strukturiert das gesamte Feld — ihr Ausmaß schwankt jedoch stark je nach Gewebe und, ein häufig übersehener Punkt, je nach Bestimmungsmethode: LC-MS-Quantifizierung und enzymatisches Cycling liefern nicht dieselben Werte, was Vergleiche zwischen Studien fragil macht. In Zell- und Tiermodellen geht die Wiederherstellung der Spiegel durch Vorstufen mit einer erhöhten Sirtuin-Aktivität und veränderten mitochondrialen Parametern einher.

Was die Literatur nicht zeigt. Die veröffentlichten Humanstudien betreffen ganz überwiegend die Vorstufen (NR, NMN), nicht NAD+ selbst. Sie belegen recht regelmäßig einen Anstieg des NAD+ im Blut, die funktionellen Endpunkte fallen jedoch von Studie zu Studie uneinheitlich aus, bei kleinen Fallzahlen und kurzen Laufzeiten, und keine große randomisierte Studie belegt einen klinischen Nutzen. Die direkte Gabe von NAD+ beim Menschen ist pharmakokinetisch kaum charakterisiert. Schließlich ist die Vorstellung, „NAD+ zu erhöhen“ sei durchweg wünschenswert, umstritten: Einige Arbeiten weisen darauf hin, dass auch rasch proliferierende Zellen auf seine Verfügbarkeit angewiesen sind.

Rekonstitution: ein Rechenbeispiel

Das Fläschchen enthält 1000 mg. Die Rekonstitution erfolgt mit bakteriostatischem Wasser, das Benzylalkohol enthält und mehrfache Entnahmen erlaubt.

Mit 2 mL bakteriostatischem Wasser in einem Fläschchen mit 1000 mg:

• erhaltene Konzentration: 1000 mg ÷ 2 mL = 500 mg/mL, also 500 000 mcg/mL;
• auf einer U-100-Spritze entspricht 1 mL 100 IE, somit 10 IE = 0,1 mL = 50 000 mcg, das heißt 50 mg;
• das Fläschchen liefert 20 Entnahmen zu je 10 IE.

Bei 1000 mg ist diese Konzentration sehr hoch, nahe an den praktischen Grenzen des Inlösungbringens, und macht jede spätere Verdünnung ungenau. Üblicherweise wird daher ein größeres Lösungsmittelvolumen gewählt. Mit 10 mL: 1000 mg ÷ 10 mL = 100 mg/mL, also 100 000 mcg/mL; 10 IE = 0,1 mL = 10 000 mcg, das heißt 10 mg, und das Fläschchen liefert 100 Entnahmen zu je 10 IE.

Der häufigste Stolperstein: Das Wasservolumen ändert niemals die Menge an Substanz im Fläschchen. Der Wechsel von 2 mL auf 10 mL fünftelt die Konzentration und verfünffacht das für dieselbe Masse zu entnehmende Volumen; die Gesamtmasse bleibt 1000 mg.

Um ein anderes Volumen oder eine andere Spritzengröße zu prüfen, rechnet unser Rekonstitutionsrechner direkt mit und zeigt die zu entnehmende Graduierung an.

Zu beachtende Handgriffe: das Lösungsmittel langsam an der Fläschchenwand entlang zugeben, ablaufen lassen, dann sanft schwenken. Weder kräftiges Schütteln noch Vortexen. Eine Besonderheit dieser Verbindung: NAD+ in Lösung ist pH-empfindlich und wird als im leicht sauren Milieu stabil und im alkalischen Milieu abbauend beschrieben — umgekehrt als NADH. Für einen enzymatischen Assay bleibt eine frisch angesetzte Lösung die Referenz.

Lagerung

Das lyophilisierte Pulver wird bei -20 °C oder darunter gelagert, vor Licht und Feuchtigkeit geschützt. Ungeöffnet und so gelagert ist das Lyophilisat über mehrere Jahre stabil.

Nach der Rekonstitution Lagerung bei 2–8 °C, vor Licht geschützt: Der Referenzzeitraum beträgt 28 Tage. Für eine längere Aufbewahrung ist das Aliquotieren in eingefrorene Fraktionen wiederholten Einfrier-Auftau-Zyklen am Hauptfläschchen vorzuziehen.

Häufige Fehler im Labor

• NAD+ wie ein Peptid behandeln. Es ist ein Dinukleotid-Coenzym: Sein Abbau in Lösung beruht auf Hydrolyse und pH-Wert, nicht auf der Denaturierung einer Aminosäurekette.
• NAD+, NMN und NR bei gleicher Masse vergleichen. Ihre molaren Massen unterscheiden sich um bis zu einen Faktor 2,6; der Vergleich ergibt nur in Mol Sinn.
• Den extrazellulären Abbau übersehen. Im Kulturmedium hydrolysieren die Ektoenzyme CD38, CD73 und NPP1 zugegebenes NAD+ vor jedem Zelleintritt: Die tatsächlich internalisierte Verbindung kann eine Vorstufe sein.
• Die Lösung in alkalischem Puffer ansetzen. NAD+ wird im Gegensatz zu NADH als im alkalischen Milieu abbauend beschrieben.
• Eine Gesamtbestimmung als Maß des aktiven Pools deuten. Die nukleären, zytosolischen und mitochondrialen Kompartimente stehen nicht frei im Gleichgewicht; ein Gesamtlysat verdeckt lokale Schwankungen.